Πιστεύεται ότι το Πυθαγόρειο είναι χτισμένο πάνω στα ερείπια της Αρχαίας Σάμου. Πολύ κοντά στο χωριό βρίσκεται το περίφημο Ευπαλίνειο Όρυγμα, το αρχαίο υδραγωγείο που χρονολογείται από τον 6ο αιώνα π.Χ.

Ο Ηρόδοτος το αποκάλεσε "Aμφίστομον ρυγμα". Κατασκευάστηκε από τον μηχανικό Ευπαλίνο. Πρόκειται για σήραγγα μήκους 1.040 μέτρων, η οποία εκτείνεται από τη βόρεια πλευρά του όρους Κάστρο έως τη νότια. Σε βάθος από 2 έως 9 μέτρα βρίσκεται το κανάλι με τον αγωγό που μετέφερε νερό στην πόλη. Σύμφωνα με ιστορικές πηγές, το υδραγωγείο αυτό χρησιμοποιήθηκε κατά την αρχαία και τη ρωμαϊκή εποχή.

Στην ίδια περιοχή, 8 χιλιόμετρα από το Πυθαγόρειο, βρίσκεται το Ηραίο, ο σημαντικότερος αρχαιολογικός χώρος του νησιού, με τον ναό της Ήρας. Ήταν ένα μεγαλοπρεπές μνημείο και ένας από τους σημαντικότερους λατρευτικούς ναούς της εποχής του.